Caracterização Bioquímica e Estrutural da Proteína Catecol O-metiltransferase (COMT) Como Potencial Alvo para Drogas Contra Paracoccidioidomicose

Nome: Fabiano Torres Cruz
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 28/03/2018
Orientador:

Nomeordem decrescente Papel
Alexandre Martins Costa Santos Co-orientador
Juliana Barbosa Coitinho Goncalves Orientador

Banca:

Nomeordem decrescente Papel
Alexandre Martins Costa Santos Coorientador
Fabiana Vasconcelos Campos Examinador Interno
Juliana Barbosa Coitinho Goncalves Orientador
Mariana Amalia Figueiredo Costa Examinador Externo

Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides, é endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país mais afetado. Atualmente, o tratamento com os antifúngicos tradicionais é usualmente longo, de alto custo, restrito a poucas classes de fármacos e com casos de resistência já relatados. A proteína catecol O-metiltransferase (COMT), que não possui estrutura resolvida em Paracoccidioides e nem em outros fungos, catalisa a metilação de um substrato catecol utilizando S-adenosilmetionina e íons Mg2+ como cofatores e parece participar de processos importantes em fungos patogênicos. Assim, sua caracterização bioquímica e estrutural poderia contribuir para o desenvolvimento de novas drogas mais efetivas para o tratamento da PCM. Para estudar a COMT, sua sequência codificadora foi clonada no vetor pET-28aTEV, que adiciona uma cauda de histidinas (His-tag) N-terminal à proteína expressa. O vetor recombinante foi então inserido nas cepas de Escherichia coli BL21, ArcticExpress, Rosetta e Rosetta-gami. A COMT recombinante foi expressa na fração solúvel da ArcticExpress e esta foi submetida à cromatografia de afinidade ao níquel seguida de gel filtração (colunas Ultrahydrogel e Superose 12). O Western blot com anticorpo anti-Histag marcou as duas bandas principais observadas no SDS-PAGE (30 e 60 kDa) da fração obtida após a afinidade. O perfil da gel filtração apresentou três picos principais (frações 1, 2 e 3) que, em SDS-PAGE, mostraram a presença de uma banda proeminente próxima a 60 kDa. As amostras das três frações foram utilizadas em ensaio de atividade para avaliar o consumo de catecol a 35 ºC e pH 7,5 sendo que a fração 2 apresentou maior relação atividade/quantidade de proteína. Cálculos teóricos das massas referentes aos picos da cromatografia de gel filtração indicam que a COMT se comporta como um dímero. A fração 2, apesar de não estar pura, foi submetida a ensaio de desnaturação térmica, onde um processo de agregação ou desnaturação foi detectado em temperaturas acima de 320 K (~47 ºC). O dicroísmo circular da fração 2 indicou um perfil de α-hélice e folhas-β diferente de outras COMT. Um modelo in silico também foi gerado e os dados estruturais obtidos podem contribuir como guia para futuras caracterizações bioquímicas.

PALAVRAS-CHAVE: Paracoccidioides, Paracoccidioidomicose, PCM, catecol O-metiltransferase, COMT.

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